解密生命密碼的PCR技術:
輕松鑒別烤串真假

2019-08-30 10:43:03來源: 中國食品報網

  PCR技術是由諾貝爾獎得主、美國生物化學家凱利·穆利斯發明的。這一技術正是通過“百萬倍復制”的方法,讓DNA攜帶的生命密碼發出振聾發聵的聲音,幫助人們將其一一捕捉。

  不久前,穆利斯的去世讓人們回想起追逐DNA密碼的艱難歲月,而PCR技術的發明給了人們解密“利器”。這也是為什么《紐約時報》評價這一技術的誕生將生物學劃分為兩個時代:PCR前時代和PCR后時代。

  初期:依靠人工完成

  穆利斯創新性的靈光一閃出現在深夜載女友開車的途中,這位有著藝術家氣質的科學家想必也是在愛人的身上找到靈感的源泉。他意識到,在將DNA雙鏈高溫解旋為單鏈后,可以用引物將需要的目標片段指數倍地擴增,在體外模仿體內的互補擴增過程。N次循環后,便可得到2n倍的DNA片段,用來進一步分析。

  初期的PCR反應體系極端簡陋、低效,且有諸多需要完善的地方。西安交通大學教授彭年才解釋說,后來其他科學家在黃石公園的溫泉里,分離得到嗜熱菌株,發現了耐熱的DNA聚合酶。這才大大提升了PCR的實驗效率,更進一步促進了PCR技術的應用和商業價值。

  秒表、水浴鍋、提籃……構成了最初期的PCR操作系統,和現代高端的PCR儀有著天壤之別。“那時候根本談不上自動,人工手動需要長時間地操作。”彭年才說,最初期的PCR反應并沒有儀器,用一個裝有PCR標本試管的提籃,用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴,由于一整套反應所需要的反應體系以及溫度并不相同,例如高溫解鏈時需要95℃、引物“粘”上DNA鏈時則是58℃,而新鏈延長則需要72℃,因此每一階段都需要換一個水浴鍋,以維持化學反應得以進行。

  標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時,然后移動,加上標本開蓋暴露點樣做電泳,因此難以控制液體污染、移動。

  無論如何簡陋和不精準,1983年12月,穆利斯用同位素標記法看到了10個循環后49bp長度的第一個PCR片段。這一“從0到1”的突破成就了后來的PCR時代。

  現代:實現精準檢測

  今年3月,國家重點研發計劃“熒光數字基因擴增單分子檢測儀”項目召開啟動會。為解決我國高端科學儀器仍受國外制約的現狀,國家重點研發計劃設立了重大科學儀器設備開發重點專項,從頂層設計層面將我國的儀器做好,達到新水平,實現市場競爭力。

  “根據穆利斯的發現形成的第一代PCR儀只能回答‘有無’的問題,即有沒有某段DNA,但人們還想回答有多少的問題。”彭年才是國家重點研發計劃的項目負責人。據他介紹,PCR儀的發展目前經歷了3代。

  第1代PCR儀器由于有了變溫器,消滅了水浴鍋和人工轉移等步驟,大大提高了效率,只需一次加入酶、引物、模板、緩沖溶液等就可以進行PCR反應;第2代PCR如實時熒光定量PCR,不僅回答有無,還想回答有多少即定量的問題,因此引入了熒光基團和感光元件,根據光強度進行實時、定量的檢測分析;第3代的數字PCR,則將反應體系再進行微小分割,理論上要讓每個微反應單元中只有單個DNA分子為模板就能實施擴增反應,實現超高靈敏度的核酸絕對定量檢測,精確地探索生命體中DNA分子的情況。

  PCR于1983年前后被發明,在穆利斯1993年獲得諾貝爾獎之前,彭年才1991年前后就開始涉足研制中國自己的PCR儀,后續帶領團隊一直專注到今天。國家重點研發計劃數字PCR項目啟動會上,院士專家也曾評價道:在目前主流的2代PCR核酸檢測產品方面,彭年才團隊自主研發的產品以多樣化解決方案和高品質高可靠的數據,成為疾病診斷和檢測控制的保障設備,同時也廣泛應用于食品安全領域食源性致病菌檢測和生物醫學科學研究。“中國自己的分子診斷儀器一度不被市場接受,有很多方面的原因,但改變人們對于國產儀器不耐用、不準確的印象或者偏見,必須靠自主研發和技藝的精進。”彭年才說。

  在3代PCR儀的角逐中,數字PCR還有諸多高技術和難點需要攻克,中國創新也在迎頭趕上。科技部國家重點研發計劃對項目承擔單位提出了要求,既要突破有針對性的核心技術,形成關鍵部件及樣機,也要具有先進性,并達到一定市場占有率,接受市場的檢驗。

  未來:應用范圍不斷拓寬

  “目前,暫沒有成熟的新技術能夠取代PCR技術。它從原理上模擬了體內的生命過程,源于真實高于真實。”彭年才說,但現代的PCR解決方案,包括反應體系建立和核酸提取PCR試劑系統,以及包括光機電、自動化、計算機、熱學等多個學科集合體的PCR儀器系統,在精度、廣度和速度上實現了不斷地超越。

  三個維度的極限超越,將使得PCR技術的應用范圍不斷拓寬。“比如,夏天晚上你想吃點燒烤,卻又疑慮這個羊肉串其實是鴨肉,這個鑒別的工作PCR技術當然能夠勝任。PCR能夠檢測出羊肉相關的特異性基因片段,但我急等吃羊肉串,等不及啊,你能否在速度上有所突破?使PCR實驗時間從小時縮短到數分鐘,這就能更廣泛地開辟應用新領域,相應也給科學家提出了新難題,從而也派生出快速PCR的新興研究領域。”彭年才表示。

  據介紹,以PCR檢測手段為代表的分子診斷目前已在醫學檢驗、疫情防控、食品安全、檢驗檢疫及法醫鑒定等方面得到廣泛應用,國家“十三五”規劃等也出臺政策,近年來中國市場每年以20%速率增長。近兩年國家器審中心審批的分子診斷產品也越來越多。

  “現在PCR檢測最快可1小時給出報告,但在很多領域還需多管齊下,更快給出診斷。”彭年才說,對于分子診斷高端設備來說,精度、廣度、速度的極限突破,將是自主創新者永恒的追求。

  (張佳星)


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